细胞培养全流程（细胞培养之新手必看）
细胞培养技术是细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的基础实验技术之一通过细胞培养可以直接观察活细胞的形态结构和生命活动，联合各种技术进行各种物理、化学生物的研究，我来为大家科普一下关于细胞培养全流程?下面希望有你要的答案，我们一起来看看吧!
细胞培养全流程
细胞培养技术是细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的基础实验技术之一。通过细胞培养可以直接观察活细胞的形态结构和生命活动，联合各种技术进行各种物理、化学生物的研究。
一、准备工作
细胞培养的准备工作是很重要，也很复杂的一项工作，应予以重视。
1.无菌室及无菌操作台
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
2.实验材料的准备
2.1玻璃器皿的清洗、干燥、消毒：1）细胞培养的和主要是玻璃容器与pasteur pipet，其它均为塑料无菌制品。2）实验用的玻璃容器与pasteur pipet使用前都要进行清洗。新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。3）用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。4）实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。2.2培养容器：种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。
2.3 培养基的配制及分装1）细胞培养基通常须添加10%血清，液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。2）粉末培养基(以1升为例)之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。高压灭菌后添加血清。
3）为避免培养基污染，可以在培养基中添加双抗(penicillin 100 units/ml streptomycin 100 ug/ml)。若实验或细胞不允许，可将培养基少量分装。操作均在无菌条件下进行。2.4 抗生素1）ATCC细胞库之细胞培养基不加抗生素 2）培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze前培养基须添加抗生素，待token freeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。3）寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml streptomycin 100 ug/ml)。4）若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。5）去除细菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml,streptomycin 250ug/ml,neomycin 250ug/ml,bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。6）抗生素使用种类与浓度：
2.5血清
1）血清必须贮存于–20～–70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。2）一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。3）瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
3.培养箱及其他仪器的检查与调试
1）CO2钢瓶之CO2压力。2）CO2培养箱之CO2浓度(5%)、温度(37度)、及更换水盘的无菌水(可添加消毒剂(Zephrin 1:750)每周更换。3）无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
4. 其他试剂的配制及灭菌
4.1 PBS(PH7.4，1L)：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可0.01M。高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，置于4度或常温保存。4.2 无菌水：双蒸水高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，常温保存。
二、细胞传代培养
工作人员穿戴实验衣及手套进入无菌室，小心取用实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。具体步骤：
粘附细胞：
1. 吸掉旧培养液。2. 用PBS洗涤细胞一至二次。3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液)。4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
悬浮细胞：
1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。
2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
三、细胞冷冻保存
步骤：1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。3. 按细胞传代培养操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液((约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vapor phase长期储存。
6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于含异丙醇的程序降温盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。
注意事项：
1. 欲冷冻保存的细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80–90％致密度。2. 冷冻前检测细胞仍保有其特有性质。3.冷冻保护剂DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以5~10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。4. 冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
四、细胞复苏
步骤：
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心，1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。3 将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
五、细胞计数与存活测试
1.存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。2. 步骤：2.1. 取50µl细胞悬浮液与50µl trypan blue (or Erythrosin bluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。2.2. 取少许混合液(约15µl)自细胞计数版上方凹槽加入，于100倍倒立显微镜下观察，或于细胞计数仪中自动检测活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosinbluish)。2.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。4 大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml
